熒光抑制
目前，抑制熒光干擾的方法有如下幾種：
一種簡(jiǎn)單的方法是加入熒光猝滅劑。但是使用這種方法的時(shí)候必須要保證樣品不會(huì )受到高濃度的熒光猝滅劑干擾，對于生物樣品來(lái)說(shuō)，這基本不可能。
另一種方法是使用比低能量吸收帶更長(cháng)的波長(cháng)激光來(lái)激發(fā)樣品（預共振激發(fā)）。利用這一思想的一項重要技術(shù)就是傅里葉變換（FT）拉曼光譜。在很多情況下，用這種方式可以獲得在高熒光中的拉曼光譜信號，但是這種方法有一些嚴重的缺陷。首先，這種激發(fā)光不會(huì )直接與任何的基團發(fā)生共振，在多組分樣本中就不能實(shí)現對特定基團的選擇性增強。其次，由于激發(fā)光受限于預激發(fā)波長(cháng)，就不能通過(guò)吸收帶來(lái)測量共振拉曼激發(fā)的輪廓曲線(xiàn)（拉曼強度是激發(fā)波長(cháng)的函數）。這是一個(gè)極其嚴重的缺陷，因為分析激發(fā)光的輪廓曲線(xiàn)對于探測色團的激發(fā)電子狀態(tài)特性是很有用的。
還有一種方法是基于拉曼散射和熒光發(fā)射可以在時(shí)間上區分開(kāi)來(lái)，使用門(mén)控和時(shí)間相關(guān)的光子計數來(lái)提供時(shí)間分辨率。該方法涉及到激光強度的高頻率調制，不止是激光器的鎖模，還用到了外部的調制器來(lái)調制激光腔，但是僅在熒光壽命相對較長(cháng)的時(shí)候才有用。
另一種區分拉曼信號和熒光背景的方法是設計激發(fā)激光的波長(cháng)調諧。這種技術(shù)通過(guò)向一個(gè)連續波染料激光器的調諧元件中引入一個(gè)低頻調制器而得以實(shí)現。波長(cháng)調制技術(shù)可應用于任何系統，但其用途受限于對激光波長(cháng)的低頻調制和鎖定檢測的專(zhuān)用設備。
上述的各種熒光消除技術(shù)方法確實(shí)發(fā)揮了一定作用，但是它們的劣勢也是顯而易見(jiàn)。
位移差分拉曼光譜
根據Kasha's rule，美國加州大學(xué)伯克利分校的研究人員提出了位移差分拉曼方法來(lái)解決熒光背景干擾的問(wèn)題。分子所發(fā)射的光（熒光或磷光）只能從某一多重態(tài)中的低態(tài)激發(fā)，因此對于激發(fā)光的微小偏移并不影響背景（樣品受激發(fā)射光譜）。獲得的拉曼光譜的熒光輪廓幾乎不發(fā)生變化。而拉曼光譜作為散射光譜特征峰出現的位置與激發(fā)光源頻譜位置有固定關(guān)系，當激發(fā)光頻率移動(dòng)時(shí)拉曼特征峰會(huì )跟著(zhù)移動(dòng)。Johannes Kiefer在文章中用寬譜光源進(jìn)行光譜成像，很形象的說(shuō)明了這一現象。圖中y代表不同激發(fā)頻率，顏色譜代表了接收到的光譜強度。對比下面的光譜圖，可以看中間有很強的一片區域是中心對稱(chēng)的，代表了不隨激發(fā)光頻率變化的受激發(fā)射光譜，而窄窄的傾斜光譜則是拉曼光譜。
位移差分拉曼光譜（SERDS），這種技術(shù)基于在兩個(gè)有輕微偏移的激發(fā)激光中收集兩張不同的光譜。首先，與以前的技術(shù)對比，不需要使用特殊的設備來(lái)改變激勵激光器的波長(cháng)。其次，使用多通道檢測，從而在給定的信號積分時(shí)間內改善了信噪比。對于現在的制冷式非加強CCD探測器，具有非常高的散粒噪聲，信噪比對于這種可以簡(jiǎn)單實(shí)現的差分方法是至關(guān)重要的。除了這些特性以外，這種方法對于短壽命的和長(cháng)壽命的熒光樣品同樣適用。
差分拉曼技術(shù)采用物理和數學(xué)相結合的熒光處理方法，常規流程如下：
首先，需要獲得采用具有已知微小波長(cháng)錯位的光源激發(fā)的拉曼光譜。將光譜的基線(xiàn)對齊，理論上對齊后光譜相減生成的曲線(xiàn)中僅包含拉曼光譜的差分信息。根據公式：
可以將差分曲線(xiàn)看作拉曼光譜橫軸顛倒后與兩個(gè)δ函數差的卷積： 
可以對差分曲線(xiàn)積分后，看作拉曼光譜與一個(gè)方波函數的卷積，通過(guò)解卷積的方式獲得真實(shí)拉曼光譜。
實(shí)際操作中雖然兩次差分光譜雖然相差不大，但是由于激光的漂白作用或激光的波動(dòng)，焦點(diǎn)位置的微小變化等各種因素都可能導致光譜曲線(xiàn)的變化。錯誤的對齊將在差分拉曼光譜重建過(guò)程中被放大，降低拉曼特征提取效果。數學(xué)操作上，光譜對齊像一個(gè)悖論。我們希望通過(guò)光譜對齊通過(guò)差分扣除光譜中的熒光部分，分離熒光和拉曼信號；但是只有我們知道準確的熒光才可能讓光譜熒光的對齊。而如果我們已經(jīng)可以清楚的區分熒光和拉曼信號，我們則沒(méi)有必要對光譜信號進(jìn)行差分。
為了解決這一問(wèn)題，常規做法是近似，根據整個(gè)光譜面積或關(guān)鍵的局部面積作為基準對譜圖進(jìn)行縮放和平移，使譜圖的匹配基本匹配。然后再對差分后產(chǎn)生的曲線(xiàn)進(jìn)行矯正，如交替小二乘法（ALS）擬合。但是由于擬合目標是未知的，所以該方法還存在很多不確定性。
申貝開(kāi)發(fā)團隊采用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )技術(shù)，基于任意函數可以被一個(gè)有三層單元的網(wǎng)絡(luò )以任意精度逼近(Cybenko 1988)這一原理。通過(guò)迭代優(yōu)解的方式，同時(shí)將差分、對齊和基線(xiàn)矯正同時(shí)完成。實(shí)驗經(jīng)過(guò)幾十次迭代（用時(shí)0.2s）可以準確分離差分信號和基線(xiàn)偏差。
目前，位移差分拉曼光譜的應用場(chǎng)景也在積極開(kāi)發(fā)中。
德國Ferdinand Braun研究所的研究人員在瑞士的一個(gè)蘋(píng)果園采用位移差分拉曼光譜技術(shù)，克服室外背景陽(yáng)光以及樣品熒光干擾，就蘋(píng)果皮和蘋(píng)果樹(shù)葉進(jìn)行了SERDS測量，獲得了蘋(píng)果的指紋特征。該團隊還基于差分拉曼技術(shù)進(jìn)行了針對人體健康的人體皮膚中胡蘿卜素的檢測研究，實(shí)現了標準樣品0.05nmol/g的檢出限。
針對紅酒中酒精和甲醇的檢測，眾所周知紅酒具有很高的熒光信號，美國和克羅地亞研究人員，通過(guò)位移激發(fā)差分拉曼技術(shù)在譜圖中恢復了葡萄酒中乙醇和甲醇的光譜，通過(guò)400次平均實(shí)現對含量在0.05%甲醇的檢測。
申貝開(kāi)發(fā)團隊采用785nm，間距1nm的差分拉曼系統，結合團隊開(kāi)發(fā)的差分拉曼解調和去噪算法，對弱激發(fā)下的樣品拉曼特征也進(jìn)行了相關(guān)研究。
科技開(kāi)發(fā)的目的絕不僅僅是技術(shù)的更新升級，如何能將技術(shù)應用與市場(chǎng)熱點(diǎn)需求深入結合，將科技成果轉換為社會(huì )生產(chǎn)力才是關(guān)鍵。Senbe開(kāi)發(fā)團隊推出的位移差分拉曼光譜技術(shù)新品突破性的解決了拉曼光譜熒光干擾的問(wèn)題，進(jìn)一步優(yōu)化和完善了拉曼光譜快檢性能，拓寬了拉曼光譜的研究和應用領(lǐng)域，對促進(jìn)拉曼光譜領(lǐng)域的科學(xué)技術(shù)與理論發(fā)展做出了重要貢獻。期待Senbe開(kāi)發(fā)團隊以及更多的拉曼領(lǐng)域科研工作者通過(guò)不懈的努力去探索和發(fā)展位移差分拉曼光譜這一新興技術(shù)，將**的拉曼光譜技術(shù)轉化為科技成果并投入規?；a(chǎn)，讓便攜式拉曼檢測技術(shù)變得更為實(shí)用和方便。
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