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技術(shù)支持

微生物檢測

微生物檢測涉及多行業(yè)和領(lǐng)域，在實(shí)驗室檢測中有著(zhù)重要的地位，微生物檢測中的一些基礎操作還是需要必要的掌握。

接種

將微生物接到適于它生長(cháng)繁殖的人工培養基上或活的生物體內的過(guò)程叫做接種。

接種和分離工具

1.接種針 2.接種環(huán) 3.接種鉤 4.5.玻璃涂棒 6.接種圈 7.接種鋤 8.小解剖刀

常用的接種方法有以下幾種：

1、劃線(xiàn)接種

這是常用的接種方法。即在固體培養基表面作來(lái)回直線(xiàn)形的移動(dòng)，就可達到接種的作用。常用的接種工具有接種環(huán)，接種針等。在斜面接種和平板劃線(xiàn)中就常用此法。

2、三點(diǎn)接種

在研究霉菌形態(tài)時(shí)常用此法。此法即把少量的微生物接種在平板表面上，成等邊三角形的三點(diǎn)，讓它各自獨立形成菌落后，來(lái)觀(guān)察、研究它們的形態(tài)。除三點(diǎn)外，也有一點(diǎn)或多點(diǎn)進(jìn)行接種的。

3、穿刺接種

在保藏菌種或研究微生物的動(dòng)力時(shí)常采用此法。做穿刺接種時(shí)，用的接種工具是接種針。用的培養基一般是半固體培養基。它的做法是：用接種針蘸取少量的菌種，沿半固體培養基中心向管底作直線(xiàn)穿刺，如某菌具有鞭毛而能運動(dòng)，則在穿刺線(xiàn)周?chē)軌蛏L(cháng)。

穿刺接種的兩種方法：垂直法和水平法

4、澆混接種

該法是將待接的微生物先放入培養皿中，然后再倒入冷卻至45℃左右的固體培養基，迅速輕輕搖勻，這樣菌液就達到稀釋的目的。待平板凝固之后，置合適溫度下培養，就可長(cháng)出單個(gè)的微生物菌落。

5、涂布接種

與澆混接種略有不同，就是先倒好平板，讓其凝固，然后再將菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作來(lái)回左右的涂布，讓菌液均勻分布，就可長(cháng)出單個(gè)的微生物的菌落。

6、液體接種

從固體培養基中將菌洗下，倒入液體培養基中，或者從液體培養物中，用移液管將菌液接至液體培養基中，或從液體培養物中將菌液移至固體培養基中，都可稱(chēng)為液體接種。

7、注射接種

該法是用注射的方法將待接的微生物轉接至活的生物體內，如人或其它動(dòng)物中，常見(jiàn)的疫苗預防接種，就是用注射接種，接入人體，來(lái)預防某些病。

8、活體接種

活體接種是專(zhuān)門(mén)用于培養病毒或其它病原微生物的一種方法，因為病毒必須接種于活的生物體內才能生長(cháng)繁殖。所用的活體可以是整個(gè)動(dòng)物；也可以是某個(gè)離體活組織，例如猴腎等；也可以是發(fā)育的雞胚。接種的方式是注射，也可以是拌料喂養。

注：有所接種必須無(wú)菌操作

培養基經(jīng)高壓后，用經(jīng)過(guò)菌的工具(如接種針和吸管等)在無(wú)菌條件下接種含菌材料(如樣品、菌苔或菌懸液等)于培養基上，這個(gè)過(guò)程叫做無(wú)菌接種操作。在實(shí)驗室檢驗中的各種接種必須是無(wú)菌操作。

(1)接種消殺 (2)開(kāi)啟棉塞 (3)管口消殺 (4)挑起菌苔 (5)接種 (6)塞好棉塞。

分離純化

含有一種以上的微生物培養物稱(chēng)為混和培養物(mixed culture)。如果在一個(gè)菌落中所有細胞均來(lái)自于一個(gè)親代細胞，那么這個(gè)菌落稱(chēng)為純培養(pureculture)。在進(jìn)行菌種鑒定時(shí)，所用的微生物一般均要求為純的培養物。得到純培養的過(guò)程稱(chēng)為分離純化，方法有許多種。

1、傾注平板法

首先把微生物懸液通過(guò)一系列稀釋?zhuān)∫欢康南♂屢号c熔化好的保持在40-50℃左右的營(yíng)養瓊脂培養基充分混合，然后把這混合液傾注到無(wú)菌的培養皿中，待凝固之后，把這平板倒置在恒箱中培養。單一細胞經(jīng)過(guò)多次增殖后形成一個(gè)菌落，取單個(gè)菌落制成懸液，重復上述步驟數次，便可得到純培養物。

2、涂布平板法

首先把微生物懸液通過(guò)適當的稀釋?zhuān)∫欢康南♂屢悍旁跓o(wú)菌的已經(jīng)凝固的營(yíng)養瓊脂平板上，然后用無(wú)菌的玻璃刮刀把稀釋液均勻地涂布在培養基表面上，經(jīng)恒溫培養便可以得到單個(gè)菌落。

3、平板劃線(xiàn)法

簡(jiǎn)單的分離微生物的方法是平板劃線(xiàn)法。用無(wú)菌的接種環(huán)取培養物少許在平板上進(jìn)行劃線(xiàn)。劃線(xiàn)的方法很多，常見(jiàn)的比較容易出現單個(gè)菌落的劃線(xiàn)方法有斜線(xiàn)法、曲線(xiàn)法、方格法、放射法、四格法等。當接種環(huán)在培養基表面上往后移動(dòng)時(shí)，接種環(huán)上的菌液逐漸稀釋?zhuān)谒鶆澋木€(xiàn)上分散著(zhù)單個(gè)細胞，經(jīng)培養，每一個(gè)細胞長(cháng)成一個(gè)菌落。

4、富集培養法

富集培養法的方法和原理非常簡(jiǎn)單。我們可以創(chuàng )造一些條件只讓所需的微生物生長(cháng)，在這些條件下，所需要的微生物能有效地與其他微生物進(jìn)行競爭，在生長(cháng)能力方面遠遠超過(guò)其他微生物。如果要分離一些專(zhuān)性寄生菌，就必須把樣品接種到相應敏感宿主細胞群體中，使其大量生長(cháng)。通過(guò)多次重復移種便可以得到純的寄生菌。

5、厭氧法

在實(shí)驗室中，為了分離某些菌，可以利用裝有原培養基的試管作為培養容器，把這支試管放在沸水0浴中加熱數分鐘，以便逐出培養基中的溶解氧。然后快速冷卻，并進(jìn)行接種。接種后，加入無(wú)菌的石蠟于培養基表面，使培養基與空氣隔絕。另一種方法是，在接種后，利用n2或co2取代培養基中的氣體，然后在火焰上把試管口密封。有時(shí)為了更有效地分離某些菌，可以把所分離的樣品接種于培養基上，然后再把培養皿放在完全密封的厭氧培養裝置中。

6、單細胞(或單孢子)分離法

是采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個(gè)細胞或單個(gè)個(gè)體進(jìn)行培養以獲得純培養。較大的微生物，可采用毛細管提取單個(gè)個(gè)體。個(gè)體相對較小的微生物，需采用顯微操作儀，在顯微鏡下用毛細管或顯微針、鉤、環(huán)等挑取單個(gè)微生物細胞或孢子以獲得純培養。單細胞分離法對操作技術(shù)有比較高的要求。

培養

1、根據培養時(shí)是否需要氧氣，可分為好氧培養和厭氧培養兩大類(lèi)。

好氧培養：也稱(chēng)“好氣培養”。就是說(shuō)這種微生物在培養時(shí)，需要有氧氣加入，否則就不能生長(cháng)良好。在實(shí)驗室中，斜面培養是通過(guò)棉花塞從外界獲得無(wú)菌的空氣。三角燒瓶液體培養多數是通過(guò)搖床振蕩，使外界的空氣源源不斷地進(jìn)入瓶中。

厭氧培養：也稱(chēng)“厭氣培養”。這類(lèi)微生物在培養時(shí)，不需要氧氣參加。在厭氧微生物的培養過(guò)程中，重要的一點(diǎn)就是要除去培養基中的氧氣。

2、根據培養基的物理狀態(tài)，可分為固體培養和液體培養兩大類(lèi)。

固質(zhì)培養：是將菌種接至疏松而富有營(yíng)養的固體培養基中，在合適的條件下進(jìn)行微生物培養的方法。

液體培養：在實(shí)驗中，通過(guò)液體培養可以使微生物迅速繁殖，獲得大量的培養物，在一定條件下，還是微生物選擇增菌的有效方法。

常規鑒定技術(shù)

(一)形態(tài)結構和培養特性觀(guān)察

1、微生物的形態(tài)結構觀(guān)察主要是通過(guò)染色，在顯微鏡下對其形狀、大小、排列方式、細胞結構(包括細胞壁、細胞膜、細胞核、鞭毛、芽孢等)及染色特性進(jìn)行觀(guān)察，直觀(guān)地了解菌在形態(tài)結構上特性，根據不同微生物在形態(tài)結構上的不同達到區別、鑒定微生物的目的。

2、菌細胞在固體培養基表面形成的細胞群體叫菌落(colony)。不同微生物在某種培養基中生長(cháng)繁殖，所形成的菌落特征有很大差異，而同一種的菌在一定條件下，培養特征卻有一定穩定性。以此可以對不同微生物加以區別鑒定。因此，微生物培養特性的觀(guān)察也是微生物檢驗鑒別中的一項重要內容。

(二)生理生化試驗

微生物生化反應：指用化學(xué)反應來(lái)測定微生物的代謝產(chǎn)物，生化反應常用來(lái)鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區別的微生物。因此微生物生化反應是微生物分類(lèi)鑒定中的重要依據之一。

微生物檢驗中常用的生化反應有：

1、糖酵解試驗

不同微生物分解利用糖類(lèi)的能力有很大差異，或能利用或不能利用，能利用者，或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣?？捎弥甘緞┘鞍l(fā)酵管檢驗。

2、淀粉水解試驗

某些菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再變藍色。

3、v-p試驗

某些菌在葡萄糖蛋白胨水培養基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱(chēng)v－p(+)反應。

4、甲基紅(methyl red)試驗

腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過(guò)程中產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養基ph值下降至ph4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。

5、靛基質(zhì)(imdole)試驗

某些菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應表現出來(lái)。吲哚與對二甲基氨基苯醛結合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。

6、硝酸鹽(nitrate)還原試驗

有些菌具有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮氣等。亞硝酸鹽的存在可用硝酸試劑檢驗。

7、明膠(gelatin)液化試驗

有些菌具有明膠酶(亦稱(chēng)類(lèi)蛋白水解酶)，能將明膠先水解為多肽，又進(jìn)一步水解為氨基酸，失去凝膠性質(zhì)而液化。

8、尿素酶(urease)試驗

有些菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生2個(gè)分子的氨，使培養基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色。尿素酶不是誘導酶，因為不論底物尿素是否存在，菌均能合成此酶。其活性ph為7.0。

9、氧化酶(oxidase)試驗

氧化酶亦即細胞色素氧化酶，為細胞色素呼吸酶系統的終末呼吸酶，氧化酶先使細胞色素c氧化，然后此氧化型細胞色素c再使對苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應。

10、硫化氫(H₂S)試驗

有些菌可分解培養基中含硫氨基酸或含硫化合物，而產(chǎn)生硫化氫氣體，硫化氫遇鉛鹽或低鐵鹽可生成黑色沉淀物。

11、三糖鐵(TSI)瓊脂試驗

本試驗可同時(shí)觀(guān)察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（變黃）；產(chǎn)生硫化氫（變黑）。葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之菌利用培養基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來(lái)又變紅，底部由于是在厭氧狀態(tài)下，酸類(lèi)不被氧化，所以仍保持黃色。

12、硫化氫-靛基質(zhì)-動(dòng)力(sim)瓊脂試驗

以接種針挑取菌落或純養物穿刺接種約1/2深度，置36±1℃培養18~24h，觀(guān)察結果。培養物呈現黑色為硫化氫陽(yáng)性，混濁或沿穿刺線(xiàn)向外生長(cháng)為有動(dòng)力，然后加Kovacs氏試劑數滴于培養表面，靜置10min，若試劑呈紅色為靛基質(zhì)陽(yáng)性。培養基未接種的下部，可作為對照。本試驗用于腸桿菌科菌初步生化篩選，與三糖鐵瓊脂等聯(lián)合使用可顯著(zhù)提高篩選功效。

(三)化學(xué)成分分析